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弥生 の 窝儿

 
 
 

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2009-11-19 15:59:57|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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师兄说我的好运用完了,我还真不信,有原因可寻,就不是运气的问题,若说背运跟误差很相似都无法去除,那么这次没长长出菌落明明是出错,无关运气,明天拭目以待。

随便上网一看,原来还真有很多运气很背的,南无阿弥陀佛!

转来别人的东西当做我的板砖,把背运轰走:

我做细胞因子的原核表达。
基因己成功克隆出来,500bp,选用PET30(a+)做表达载体。
克隆引物插入了酶切位点,所以回收产物和PET分别酶切(ecor1和xho1),回收后,用T4连接过夜。
这个步骤我做了六遍,其中四次转化JM109后KAN+平板一个菌没长,后两次分别长了四个和一个,鉴定阴性。
连接体系做过25、15、10微升,我也做过从T载体上切目的片段,全都没有连接上。
现在分析不出什么原因连接不到表达载体上?
请各位老师和高手指教,不胜感激……

————————————————————————————————————————

一般连接是20ul,我们一般是将外源片段和载体双切后纯化,我习惯将纯化的东西取1ul跑电泳看一下,如果比较亮就可以来做连接,连接一般是20ul体系:1ul载体,1ul连接酶,2ulbuffer,然后用外源片段补足剩下的体积,不加水。我试过加水,按载体:外源=1:10,没有连接上,还试过上面用外源补足的方法,连接成功,你不妨试一试,祝好运!

谢谢回复!
我的连接物浓度有可能不够,因为回收酶切产物时带不是很亮,我先把浓度提高上去,再连连试试。
再次感谢!
:)

500bp大小的纯化后不会很亮,有T载体的话,现测定T载体的浓度和ECTOR的浓度,各取1ug作酶切,根据ector的片断大小,可以初步估算insert 和ector所需的量。(如同是1ug的T载体(约4kb)和ector,ector大小为4Kb,那么T载体切小的带(insert,500bp)与载体的摩尔比大约为8:1,再切下胶根据insert和ector的合适比例来作连接。另,感受态的效率也是个关键。建议连接多次出不来的时候,做做阳性对照和阴性多照,不会增加工作量,但能准确找到原因。下次就成功了。

xymo wrote:
500bp大小的纯化后不会很亮,有T载体的话,现测定T载体的浓度和ECTOR的浓度,各取1ug作酶切,根据ector的片断大小,可以初步估算insert 和ector所需的量。(如同是1ug的T载体(约4kb)和ector,ector大小为4Kb,那么T载体切小的带(insert,500bp)与载体的摩尔比大约为8:1,再切下胶根据insert和ector的合适比例来作连接。另,感受态的效率也是个关键。建议连接多次出不来的时候,做做阳性对照和阴性多照,不会增加工作量,但能准确找到原因。下次就成功了。


谢谢回复!
我用制备的感受态转PET空载体了,长满满一片儿!
我想还是INSERT和ECTOR的比例没找对,我会分别提高浓度再尝试的,谢谢你!

你的连接温度是多少?
我以前一直4度过夜连,也没连上;后改用16度过夜就成功了。
我用pet41

___________________________________________________________________________

 

目的基因片段与pet载体连接构建表达载体,菌落长不出来的问题

解决时间:2009-03-10 19:18

我最近正在做我的目的基因片段与pet载体连接构建表达载体的实验。
首先把目的基因从重组T载体上酶切回收,再将pet28a双酶切后回收,两者以一定比例混合进行连接反应16h,再转化JM109并涂布kan抗性平板,但糟糕的是连单克隆菌落都长不出来,我已经做了好几次,都长不出菌落。想请各位高手指点!我的实验现在已经没法往下做了!

  • 匿名提问 2009-03-09

最佳答案 

1、pET质粒并不都是抗AMP的,pET28a确实是抗KANA的,而且用bamH1和Xho1两种酶酶切不可能将抗KANA基因切掉;
2、将T载体上的目的基因片段切回收后,应该跑个电泳,看看回收效率如何;
3、将pET28质粒双酶切后,也应该应该跑个电泳,看看酶切效率如何;
4、建议换一下连接酶,是不是原来放的时间长了?
5、连接体系可以作20或30ul体系的,相同浓度时,比例可以按目的基因:质粒=2:1, 2.5:1, 3:1(体积比例)作个梯度,连接时间长一点到24h没关系;
6、转化时同时做一个空质粒对照,看看效果如何;
7、转化时注意离心,重悬动作都要小心,还有涂布棒一定要足够冷却,不要把菌体都烫死了,还有一种一步法制备感受态转化的方法,效果不错,可以试一下
TSS方法制备感受态细菌(又称一步法)
一、  准备工作
1、  缓冲液1×TSS的配制:
事先配制1M的氯化镁——20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装,不用灭菌。
取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯,用量筒量取100ml去离子水,加入至烧杯中,取 1 g 蛋白胨,0.5g 酵母抽提物,0.5g 氯化钠,10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO,5ml 的1 M氯化镁,溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5,混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度,保质期约6个月。
2、 已划平板(或者用枪头沾取并稀释后涂布)并在培养箱中过夜培养的菌种——Dh5α,用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶,分别装有30 ml和50mlLB,灭菌后置于4℃冰箱备用。
3、  若干已灭菌的琼脂平板,一个未加抗生素,用于第二步的接种。其余做转化用。
二、  感受态制备程序:
1、前一天晚上调单菌落至30 mlLB中过夜培养(12-16h),按1:100 比例将过夜培养的菌液(500ul)加入到新鲜的50 ml LB培养液中,于37 ℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40~50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min,弃上清,收获细菌。加入原体积十分之一(这里为5 ml)的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞,然后分装成100 ul/份,全部冰上操作,-80度保存。
三、  转化时取一管(100 ul)感受态细菌,(冻寸细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用)加入3-5ul DNA(0.1~100ng),轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液,37度150r/min温和振荡培养 60min,涂布,室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养(17-20h)。
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